Dihidrofolato redutase

dihydrofolate reductase
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A dihidrofolato redutase ou DHFR é uma enzima que reduz o ácido di-hidrofólico a ácido tetraidrofólico usando NADPH como doador de eletrões, o qual pode converter-se depois nos tipos de cofatores tetraidrofolato utilizados na química de transferência de um carbono. Nos humanos, a enzima DHFR é codificada pelo gene DHFR^[1][2] situado na região q14.1 do cromossomo 5.^[3] Há duas classes estruturais de DHFR, que não estão relacionadas evolutivamente entre si. O mencionado anteriormente é o que geralmente se chama DHFR e encontra-se em cromossomos bacterianos e de animais. Contudo, nas bactérias, a pressão exercida pelos antibióticos fez com que nesta classe evoluíssem diferentes maneiras de ligar-se a moléculas diamino-heterocíclicas, originando diversos "tipos" incluídos nesta classe, enquanto que os de mamíferos permaneceram com características muito semelhantes.^[4] A segunda das classes (as de tipo II) está representada pela R67 codificada em plasmídeos, que é uma enzima diminuta que funciona formando um homotetrâmero.^[5]

A dihidrofolato redutase converte o di-hidrofolato em tetraidrofolato, uma lançadeira de prótões necessária para a síntese de novo de purinas, ácido timidílico e certos aminoácidos. Embora o gene funcional da dihidrofolato redutase se tenha mapeado no cromossomo 5, identificaram-se múltiplos pseudogenes processados sem íntrões semelhantes ao da dihidrofolato redutase situados noutros cromossomos.^[6]

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  Via de síntese do tetraidrofolato.

A DHFR, que se encontra em todos os organismos, tem um papel fundamental na regulação da quantidade de tetraidrofolato da célula. O tetraidrofolato e os seus derivados são essenciais para a síntese de purinas e timidilato, que são importantes para a proliferação e crescimento celular.^[7] A DHFR joga um papel central na síntese de precursores de ácidos nucleicos, e observou-se que as células mutantes que carecem completamente de DHFR necessitam para crescer glicina, uma purina e timidina.^[8] A DHFR é também uma enzima envolvido no resgate de tetra-hidrobiopterina a partir de di-hidrobiopterina.^[9][10]

A principal característica do enovelamento do esqueleto polipeptídico da DHFR é uma folha beta de 8 febras.^[11] Sete destas febras são paralelas e a oitava discorre antiparalela. Quatro hélices alfa conectam as sucessivas febras beta.^[12] Os resíduos 9–24 denominam-se "Met20" ou "alça 1" e, juntamente com outras alças, fazem parte do subdomínio principal que rodeia o sítio ativo.^[13] O sítio ativo está situado na metade N-terminal da sequência, que inclui um dipéptido conservado Pro-Trp; o triptofano está envolvido na ligação da enzima com o substrato.^[12]

A DHFR catalisa a transferência de um hidreto do NADPH ao di-hidrofolato acompanhada de uma protonação para produzir tetraidrofolato.^[7] Ao final, o di-hidrofolato é reduzido a tetraidrofolato e o NADPH é oxidado a NADP⁺. A grande flexibilidade do Met20 e outras alças próximas ao sítio ativo desempenham um papel na promoção da libertação do produto, o tetraidrofolato. Em concreto, a alça Met20 ajuda a estabilizar o anel de nicotinamida do NADPH para promover a transferência do hidreto do NADPH ao di-hidrofolato.^[13] O mecanismo deste enzima funciona passo a passo e é aleatório em estado estacionário. A reação catalítica começa com a ligação do NADPH e do substrato ao sítio ativo da enzima, seguida da protonação e transferência de hidreto do cofator NADPH ao substrato. Contudo, os dois últimos passos não ocorrem simultaneamente no mesmo estado de transição.^[14][15] Num estudo em que se usaram estratégias computacionais e experimentais, Liu et al concluíram que o passo de protonação precede a transferência do hidreto.^[16]

O mecanismo enzimático da DHFR é dependente do pH, particularmente o passo da transferência do hidreto, já que as mudanças de pH têm uma considerável influência na eletrostática do sítio ativo e no estado de inonização dos seus resíduos.^[16] A acidez do nitrogénio afetado do substrato é importante na ligação do substrato ao sítio de ligação da enzima, que se demonstrou ser hidrófobo apesar de estar em contacto direto com a água.^[14][17] O Asp27 é o único resíduo hidrófilo carregado do sítio de ligação, e a neutralização da carga do Asp27 pode alterar o pKa da enzima. O Asp27 joga um papel crítico no mecanismo catlítico ajudando com a protonação do substrato e restringindo o substrato na conformação favorável para a transferência do hidreto.^[18][14][17] O passo de protonação está associado com a tautomerização enol mesmo se esta conversão não se considera favorável para doar prótons.^[15] Uma molécula de água está envolvida no passo de protonação.^[19][20][21] A entrada da molécula de água no sítio ativo da enzima é facilitda pela alça Met20.^[22]

O ciclo catalítico da reação catalisada pela DHFR incorpora cinco intermediários importantes: holoenzima (E:NADPH), complexo de Michaelis (E:NADPH:DHF), complexo ternário do produto (E:NADP⁺:THF), complexo binário do tetraidrofolato (E:THF), e complexo THF‚NADPH (E:NADPH:THF). O passo da dissociação do produto (THF) do E:NADPH:THF ao E:NADPH é o passo limitante da velocidade durante o recâmbio do estado estacionário.^[18] As alterações conformacionais são fundamentais no mecanismo catalítico da DHFR.^[23] A alça Met20 da DHFR pode abrir, fechar ou ocluir o sítio ativo.^[20][14] Em correspondência, atribuíram-se três conformações ao Met20 classificadas como estados aberto, fechado e ocluído. Além disso, definiu-se uma conformação distorcida extra do Met20 devido ao caráter indistinto dos resultados.^[20] A alça Met20 observa-se na sua conformação ocluída nos três intermediários que se ligam ao produto, nos quais o anel de nicotinamida está ocluído do sítio ativo. Esta característica conformacional explica que a substituição do NADP⁺ por NADPH ocorre antes da dissociação do produto. Desta maneira, pode ocorrer a seguinte ronda de reação depois da ligação do substrato.^[18]

Devido à sua estrutura única e características catalíticas, a DHFR R67 é muito estudada. A DHFR R67 é uma DHFR de tipo II codificada no plasmídeo R sem relação genética ou estrutural com a DHFR cromossómica de Escherichia coli. É um homotetrâmero que possui simetria 222 com um só poro de sítio ativo que está exposto ao solvente.^[24] Esta simetria do sítio ativo tem como resultado o modo de ligação diferente que a enzima apresenta: pode ligar-se a duas moléculas de di-hidrofolato (DHF) com cooperatividade positiva ou a duas moléculas de NADPH com cooperatividade negativa, ou a um substrato mais a outro, mas só o último tem a atividade catalítica.^[25] Comparado com a DHFR cromossómica de E. coli, tem uma maior K_m na ligação do di-hidrofolato (DHF) e NADPH. A cinética catalítica muito menor mostra que a transferência de hidreto é o passo limitante da velocidade e não a libertação do produto (THF).^[26]

Na estrutura da DHFR R67, o homotetrâmero forma um poro de sítio ativo. No processo catlítico, o DHF e o NADPH entram no poro a partir de posições opostas. A interação de empilhamento π-π entre o anel de nicotinamida do NADPH e o anel de pteridina do DHF conectam estreitamente dois reagentes no sítio ativo. Contudo, observou-se uma flexibilidade da cauda p-aminobenzoilglutamato do DHF depois da ligação, o qual pode promover a formação do estado de transição.^[27]

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  Diferença na estrutura da ligação do substrato em EcDHFR e DHFR R67.

As mutações na DHFR causam deficiência de di-hidrofolato redutase, uma rara doença congénita autossómica recessiva do metabolismo do folato que tem como resultado anemia megaloblástica, pancitopenia e deficiência de folato cerebral grave. Estes problemas podem ser superados pela suplementação com uma forma reduzida do folato, normalmente ácido folínico.^[6][28][29]

A DHFR é um alvo farmacêutico atraente para a inibição pelo seu papel central como precursor da timina para a síntese do ADN. O trimetoprim, um antibiótico, inibe a DHFR bacteriana, enquanto o metotrexato, um agente quimioterápico, inibe a DHFR de mamíferos. Contudo, desenvolveu-se resistência contra alguns destes fármacos, como resultado de alterações mutacionais na própria DHFR.^[30]

A DHFR é responsável pelos níveis de tetraidrofolato na célula, e a inibição da DHFR pode limitar o crescimento e proliferação de células que são características do cancro e de infeções bacterianas. O metotrexato, um inibidor competitivo da DHFR, é um desses fármacos anticancro que inibe a DHFR.^[31] O folato é necessário para o crescimento,^[32] e a via do metabolismo do folato é um alvo em tratamentos em desenvolvimento para o cancro. A DHFR é um desses alvos. Um tratamento com fluorouracilo, doxorrubicina e metotrexato prolonga a sobrevivência de pacientes com cancro gástrico avançado.^[33] Mais estudos sobre inibidores da DHFR podem dar origem a mais formas de tratar o cancro.

As bactérias também necessitam da DHFR para crescer e multiplicar-se e, portanto, os inibidores seletivos para a DHFR bacteriana encontraram aplicação como agentes antibacterianos.^[34] O trimetoprim tem atividade contra diversos patógenos bacterianos gram-positivos.^[34] Contudo, a resistência ao trimetoprim e outros fármacos dirigidos contra a DHFR pode surgir por diversos mecanismos, limitando o sucesso dos seus usos terapêuticos.^[35][36][37] A resistência pode surgir pela amplificação do gene DHFR, mutações na DHFR,^[38][39] diminuição na captação desses fármacos, entre outros. Apesar de tudo, o trimetoprim e o sulfametoxazol em combinação foram utilizados como agentes antibacterianos durante décadas.^[34] A pirimetamina é um agente antiprotozoário muito usado.^[40] Outras classes de compostos que têm como alvo a DHFR em geral, e as DHFRs bacterianas em particular, pertencem a classes como as diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, calconas, desoxibenzoínas, diaminoquinazolinas, diaminopirroloquinazolinas, entre outras.

A DHDR de Bacillus anthracis (BaDHFR) é um alvo de fármacos validado para o tratamento da doença infecciosa do antraz. A BaDHFR é menos sensível a análogos do trimetoprim do que é a dihidrofolato redutase de outras espécies como Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae. Um alinhamento estrutural da dihidrofolato redutase dessas quatro espécies mostra que só a BaDHFR tem a combinação de fenilalanina e tirosina nas posições 96 e 102, respetivamente. A resistência da BaDHFR a análogos do trimetoprim deve-se a estes dois resíduos (F96 e Y102), que também lhe melhoram a cinética e a eficiência catalítica.^[41] A investigação atual usa sítios ativos na BaDHFR para guiar a otimização de novos inibidores antifolato.^[41]

A DHFR utilizou-se como ferramenta para detetar interações proteína-proteína num ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA), usando uma estratégia de proteína dividida.^[42] As células CHO carentes de DHFR são a linha celular mais usada para a produção de proteínas recombinantes. Estas células são transfectadas com um plasmídeo que porta o gene dhfr e o gene para a proteína recombinante num só sistema de expressão, e depois são submetidas a condições seletivas e a meio de crescimento sem timidina. Somente sobrevivem as células com o gene DHFR exógeno juntamente com o gene de interesse. A suplementação deste meio com metotrexato, um inibidor competitivo da DHFR, pode fazer uma ulterior seleção das células que expressam os maiores níveis de DHFR, e assim, selecionar os melhores produtores de proteínas recombinantes.^[43]

A dihidrofolato redutase interacciona com GroEL^[44] e Mdm2.^[45]

Referências