Inibição competitiva

A inibição competitiva é a interrupção de uma reação ou via química devido a uma substância química que inibe o efeito de outra ao competir com ela para se ligar quimicamente a uma terceira, seja em enzimologia ou noutros processos químicos. Qualquer sistema metabólico ou mensageiro químico poderia ser afetado por este princípio, mas várias classes de inibição competitiva são especialmente importantes em bioquímica e medicina, incluindo a inibição enzimática de tipo competitivo, a forma competitiva do antagonismo de recetor, a forma competitiva da atividade de antimetabólitos, e a forma competitiva dos envenenamentos (a qual pode incluir qualquer um dos tipos antes mencionados).

Na inibição competitiva da catálise enzimática, a ligação de um inibidor impede a ligação da molécula sobre a qual a enzima atua, chamada substrato.^[1] Isto é realizado bloqueando o local de ligação do substrato – o local ativo – por algum mecanismo. A V_max indica a velocidade máxima da reação, enquanto que a K_m é a quantidade de substância necessária para atingir metade da V_max. A K_m também serve para indicar a tendência do substrato a ligar-se à enzima.^[2] A inibição competitiva pode ser superada adicionando mais substrato à reação, o que aumenta as hipóteses de a enzima e o substrato se ligarem. Como resultado, a inibição competitiva altera apenas a K_m, deixando a V_max igual.^[3] Isto pode ser demonstrado usando gráficos da cinética enzimática como a de Michaelis-Menten ou a de Lineweaver-Burk. Uma vez que o inibidor se ligou à enzima, a inclinação é alterada, já que a K_m faz aumentar ou diminuir a K_m original da reação.^[4][5][6]

A maioria dos inibidores competitivos funciona ligando-se reversivelmente ao local ativo da enzima.^[1] Como resultado, muitas fontes afirmam que esta é a caraterística definidora dos inibidores competitivos.^[7] Contudo, isto é uma simplificação excessiva que pode levar à confusão, já que há muitos mecanismos possíveis pelos quais uma enzima pode ligar-se a um inibidor ou ao substrato, mas nunca a ambos ao mesmo tempo.^[1] Por exemplo, os inibidores alostéricos podem mostrar inibição competitiva, não-competitiva ou incompetitiva (ou acompetitiva).^[1]

Na inibição competitiva, um inibidor que se assemelha ao substrato normal liga-se à enzima, geralmente no sítio ativo, e impede que o substrato se ligue.^[8] Num dado momento, a enzima pode estar ligada ao inibidor, ao substrato, ou a nenhum dos dois, mas não pode estar ligada a ambos ao mesmo tempo. Durante a inibição competitiva, o inibidor e o substrato competem pelo sítio ativo. O sítio ativo é a região da enzima à qual se pode ligar uma determinada proteína ou substrato. O sítio ativo só permite que um dos dois complexos se ligue ao sítio, ou permite que ocorra uma reação ou rendimento de um produto. Na inibição competitiva um inibidor parecido com o substrato ocupa o seu lugar ao ligar-se ao sítio ativo da enzima. Aumentando a concentração de substrato diminuirá a "competição" para que o substrato se ligue corretamente ao sítio ativo e a reação ocorra.^[3] Quando o substrato está em maior concentração do que o inibidor competitivo, as probabilidades de ser o substrato a entrar em contacto com o sítio ativo da enzima são maiores do que as que tem o inibidor.

Os inibidores competitivos são frequentemente utilizados para fabricar fármacos.^[3] Por exemplo, o metotrexato é um quimioterápico que atua como inibidor competitivo. É estruturalmente semelhante à coenzima, o folato, que se liga à enzima di-hidrofolato redutase.^[3] Esta enzima está envolvida na síntese do ADN e ARN, e quando o metotrexato se liga à enzima, esta fica inativa, assim que não se pode sintetizar ADN ou ARN.^[3] Nessas circunstâncias, as células cancerosas são, portanto, incapazes de crescer e dividir-se. Outro exemplo: as prostaglandinas são produzidas em grandes quantidades como resposta à dor e podem causar inflamação. Os ácidos gordos essenciais são utilizados para formar as prostaglandinas; quando isto foi descoberto, verificou-se que estes eram também inibidores muito bons dos efeitos das prostaglandinas. Estes ácidos gordos inibidores foram utilizados como fármacos para aliviar a dor porque podem atuar como substrato, e ligar-se à enzima que sintetiza as prostaglandinas, e bloquear a sua produção.^[9]

Um exemplo de inibição competitiva não relacionada com fármacos é a que intervém na prevenção do murchamento (escurecimento enzimático) de frutas e vegetais. Por exemplo, a tirosinase, uma enzima dos cogumelos, normalmente liga-se aos seus substratos, os monofenóis, e forma o-quinonas castanhas.^[10] Os substratos competitivos, como os benzaldeídos substituídos na posição 4 dos cogumelos, competem com o substrato, diminuindo a quantidade de monofenóis que se ligam. Estes compostos inibidores são adicionados para fazer com que os vegetais se mantenham frescos durante longos períodos de tempo ao diminuírem a ligação de monofenóis que causam o murchamento .^[10] Isto permite um aumento da vida do produto nas lojas.

A inibição competitiva pode ser reversível ou irreversível. Se é uma inibição reversível, então os efeitos da inibição podem ser superados aumentando a concentração de substrato.^[8] Se é irreversível, a única maneira de superá-lo é produzindo mais enzimas (e degradar ou excretar a enzima inibida irreversivelmente).

Virtualmente em todos os casos, os inibidores competitivos ligam-se no mesmo sítio de ligação (o sítio ativo) que o substrato, mas não é imprescindível que seja o mesmo sítio de ligação. Um inibidor competitivo poderia ligar-se a um sítio alostérico da enzima livre e impedir a ligação do substrato, desde que não se ligue ao sítio alostérico no momento em que o substrato está ligado à enzima. Por exemplo, a estricnina atua como um inibidor alostérico do recetor da glicina na medula espinhal e no tronco cerebral de mamíferos. A glicina é um importante neurotransmissor pós-sináptico com um sítio recetor específico. A estricnina liga-se a um sítio alternativo que reduz a afinidade do recetor da glicina pela glicina, o que resulta em convulsões devido à diminuição da inibição pela glicina.^[11]

Na inibição competitiva, a velocidade máxima (${\displaystyle V_{\max }}$) não muda, enquanto que a afinidade aparente do substrato com o sítio de ligação diminui (a constante de dissociação ${\displaystyle K_{d}}$ aparentemente aumenta). A alteração na ${\displaystyle K_{m}}$ (constante de Michaelis-Menten) é paralela à alteração de ${\displaystyle K_{d}}$, já que enquanto uma aumenta a outra deve diminuir. Quando um inibidor competitivo se liga a uma enzima, a ${\displaystyle K_{m}}$ aumenta. Isto significa que a afinidade de ligação pela enzima diminui, mas isto pode ser superado aumentando a concentração do substrato.^[12] O efeito de qualquer concentração dada de inibidor competitivo pode ser superado aumentando a concentração de substrato. Nesse caso, o substrato reduzirá a disponibilidade de moléculas inibidoras que se possam ligar, e assim, supera na competição ao inibidor na hora de se ligar à enzima.^[12]

Após uma ingestão acidental de uma droga opiácea contaminada, a desmetilprodina, descobriu-se o efeito neurotóxico da 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). A MPTP pode cruzar a barreira hematoencefálica e entrar nos lisossomas ácidos.^[13] A MPTP é ativada biologicamente pela MAO-B, uma isoenzima da monoamina oxidase (MAO) que está concentrada principalmente nos transtornos e doenças neurológicas.^[14] Posteriormente, descobriu-se que a MPTP causa sintomas semelhantes à doença de Parkinson. As células do sistema nervoso central (astrócitos) têm MAO-B que oxida MPTP a 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+), que é tóxico.^[13] O MPP+ viaja finalmente para o fluido extracelular por meio de um transportador de dopamina, o que em último extremo causa os sintomas de Parkinson. Contudo, a inibição competitiva da enzima MAO-B ou do transportador de dopamina protege contra a oxidação da MPTP a MPP+. Testaram-se alguns compostos para comprovar a sua capacidade de inibir a oxidação da MPTP a MPP+, como o azul de metileno, o 5-nitroindazol, o nor-harman, o 9-metilnor-harman e a menadiona.^[14] Estes demonstraram uma redução da neurotoxicidade produzida pela MPTP.

As sulfamidas também atuam como inibidores competitivos. Por exemplo, a sulfanilamida liga-se competitivamente a uma enzima no sítio ativo da di-hidropteroato sintase (DHPS) ao imitar o substrato ácido para-aminobenzoico (PABA).^[15] Isto impede que o próprio substrato se ligue, o que interrompe a produção de ácido fólico, um nutriente essencial. As bactérias devem sintetizar ácido fólico porque não têm um transportador para ele. Sem ácido fólico, as bactérias não podem crescer e dividir-se. Portanto, devido à inibição competitiva dos fármacos sulfamidas, estes são excelentes agentes antibacterianos.

Um exemplo de inibição competitiva demonstrou-se experimentalmente na enzima succinato desidrogenase, que catalisa a oxidação do succinato a fumarato no ciclo do ácido cítrico ou de Krebs. O malonato é um inibidor competitivo da succinato desidrogenase. A ligação da succinato desidrogenase ao substrato, o succinato, é inibida competitivamente. Isto acontece porque a química do malonato é semelhante à do succinato. A capacidade do malonato de inibir a ligação da enzima e do substrato está baseada na proporção de malonato para succinato. O malonato liga-se ao sítio ativo da succinato desidrogenase para que o succinato não o possa fazer. Assim, inibe a reação.^[16]

O modelo de Michaelis-Menten pode ser uma ferramenta valiosa para compreender a cinética enzimática. Segundo este modelo, um gráfico da velocidade de reação (V₀) associada à concentração de substrato [S] pode então ser utilizado para determinar valores como V_max, velocidade inicial e K_m (V_max/2 ou afinidade do complexo enzima-substrato).^[4] A inibição competitiva aumenta o valor aparente da constante de Michaelis-Menten, ${\displaystyle K_{m}^{\text{app}}}$, tal que a velocidade da reacção, ${\displaystyle V_{0}}$, é dada por

${\displaystyle V_{0}={\frac {V_{\max }\,[S]}{K_{m}^{\text{app}}+[S]}}}$

onde ${\displaystyle K_{m}^{\text{app}}=K_{m}(1+[I]/K_{i})}$, ${\displaystyle K_{i}}$ é a constante de dissociação do inibidor e ${\displaystyle [I]}$ é a concentração do inibidor.

${\displaystyle V_{\max }}$ permanece igual porque a presença do inibidor pode ser superada por uma concentração maior do substrato. ${\displaystyle K_{m}^{\text{app}}}$, A concentração de substrato que é necessária para atingir ${\displaystyle V_{\max }/2}$, aumenta com a presença de um inibidor competitivo. Isto deve-se a que a concentração de substrato necessária para atingir a ${\displaystyle V_{\max }}$ com um inibidor é maior do que a concentração de substrato necessária para atingir a ${\displaystyle V_{\max }}$ sem inibidor.

No caso mais simples de uma enzima com um só substrato que obedece à cinética de Michaelis-Menten, o esquema típico :

${\displaystyle {\ce {E + S <=>[k_1][k_{-1}] ES ->[k_2] E + P}}}$

é modificado para incluir a ligação do inibidor com enzimas livres:

${\displaystyle {\ce {EI + S <=>[k_{-3}][k_3] E + S + I <=>[k_1][k_{-1}] ES + I ->[k_2] E + P + I}}}$

Note-se que o inibidor não se liga ao complexo ES e o substrato não se liga ao complexo EI. Assume-se geralmente que este comportamento é indicativo da ligação de ambos os compostos ao mesmo sítio, mas que não é estritamente necessário. Tal como na derivação da equação de Michaelis-Menten, supõe-se que o sistema está no estado estacionário, ou seja, a concentração de cada uma das espécies de enzima não está a mudar.

${\displaystyle {\frac {d[{\ce {E}}]}{dt}}={\frac {d[{\ce {ES}}]}{dt}}={\frac {d[{\ce {EI}}]}{dt}}=0.}$

Além disso, a concentração de enzima total conhecida é ${\displaystyle [{\ce {E}}]_{0}=[{\ce {E}}]+[{\ce {ES}}]+[{\ce {EI}}]}$, e a velocidade é medida em condições nas quais as concentrações de substrato e inibidor não mudam substancialmente e se acumulou uma quantidade insignificante de produto. Portanto, podemos utilizar o seguinte sistema de equações:

${\displaystyle [{\ce {E}}]_{0}=[{\ce {E}}]+[{\ce {ES}}]+[{\ce {EI}}]}$

(1)

${\displaystyle {\frac {d[{\ce {E}}]}{dt}}=0=-k_{1}[{\ce {E}}][{\ce {S}}]+k_{-1}[{\ce {ES}}]+k_{2}[{\ce {ES}}]-k_{3}[{\ce {E}}][{\ce {I}}]+k_{-3}[{\ce {EI}}]}$

(2)

${\displaystyle {\frac {d[{\ce {ES}}]}{dt}}=0=k_{1}[{\ce {E}}][{\ce {S}}]-k_{-1}[{\ce {ES}}]-k_{2}[{\ce {ES}}]}$

(3)

${\displaystyle {\frac {d[{\ce {EI}}]}{dt}}=0=k_{3}[{\ce {E}}][{\ce {I}}]-k_{-3}[EI]}$

(4)

onde se conhecem

${\displaystyle {\ce {[S], [I]}}}$ e ${\displaystyle {\ce {[E]_0}}}$.

A velocidade inicial define-se como ${\displaystyle V_{0}=d[{\ce {P}}]/dt=k_{2}[{\ce {ES}}]}$, assim precisamos de definir a ${\displaystyle {\ce {[ES]}}}$ desconhecida em relação às ${\displaystyle {\ce {[S], [I]}}}$ e ${\displaystyle {\ce {[E]_0}}}$ conhecidas.

Da equação (3), podemos definir E em termos de ES rearranjando-a para

${\displaystyle k_{1}[{\ce {E}}][{\ce {S}}]=(k_{-1}+k_{2})[{\ce {ES}}]}$

Dividindo por ${\displaystyle k_{1}[{\ce {S}}]}$ dá :

${\displaystyle [{\ce {E}}]={\frac {(k_{-1}+k_{2})[{\ce {ES}}]}{k_{1}[{\ce {S}}]}}}$

Tal como na derivação da equação de Michaelis-Menten, o termo ${\displaystyle (k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$ pode ser substituído por uma constante de velocidade macroscópica ${\displaystyle K_{m}}$:

${\displaystyle [{\ce {E}}]={\frac {K_{m}[{\ce {ES}}]}{\ce {[S]}}}}$

(5)

Substituindo a equação (5) na equação (4), temos :

${\displaystyle 0={\frac {k_{3}[{\ce {I}}]K_{m}[{\ce {ES}}]}{\ce {[S]}}}-k_{-3}[{\ce {EI}}]}$

Operando, obtemos que :

${\displaystyle [{\ce {EI}}]={\frac {K_{m}k_{3}[{\ce {I}}][{\ce {ES}}]}{k_{-3}[{\ce {S}}]}}}$

Neste momento, podemos definir a constante de dissociação para o inibidor como ${\displaystyle K_{i}=k_{-3}/k_{3}}$, dando

${\displaystyle [{\ce {EI}}]={\frac {K_{m}[{\ce {I}}][{\ce {ES}}]}{K_{i}[{\ce {S}}]}}}$

(6)

Agora, substituímos a equação (5) e a equação (6) na equação (1):

${\displaystyle [{\ce {E}}]_{0}={\frac {K_{m}[{\ce {ES}}]}{\ce {[S]}}}+[{\ce {ES}}]+{\frac {K_{m}[{\ce {I}}][{\ce {ES}}]}{K_{i}[{\ce {S}}]}}}$

Operando para isolar ES, temos

${\displaystyle [{\ce {E}}]_{0}=[{\ce {ES}}]\left({\frac {K_{m}}{\ce {[S]}}}+1+{\frac {K_{m}[{\ce {I}}]}{K_{i}[{\ce {S}}]}}\right)=[{\ce {ES}}]{\frac {K_{m}K_{i}+K_{i}[{\ce {S}}]+K_{m}[{\ce {I}}]}{K_{i}[{\ce {S}}]}}}$

${\displaystyle [{\ce {ES}}]={\frac {K_{i}[{\ce {S}}][{\ce {E}}]_{0}}{K_{m}K_{i}+K_{i}[{\ce {S}}]+K_{m}[{\ce {I}}]}}}$

(7)

Voltando à nossa expressão de ${\displaystyle V_{0}}$, agora temos:

${\displaystyle V_{0}=k_{2}[{\ce {ES}}]={\frac {k_{2}K_{i}[{\ce {S}}][{\ce {E}}]_{0}}{K_{m}K_{i}+K_{i}[{\ce {S}}]+K_{m}[{\ce {I}}]}}}$

${\displaystyle V_{0}={\frac {k_{2}[{\ce {E}}]_{0}[{\ce {S}}]}{K_{m}+[{\ce {S}}]+K_{m}{\frac {[{\ce {I}}]}{K_{i}}}}}}$

Dado que a velocidade é máxima quando todas as enzimas estão ligadas na forma complexo enzima-substrato, ${\displaystyle V_{\max }=k_{2}[{\ce {E}}]_{0}}$. Substituindo e combinando termos obtemos finalmente a forma convencional:

${\displaystyle V_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{m}\left(1+{\frac {[{\ce {I}}]}{K_{i}}}\right)+[{\ce {S}}]}}}$

(8)

Para calcular a concentração de inibidor competitivo ${\displaystyle {\ce {[I]}}}$ que produz uma fração ${\displaystyle f_{V{_{0}}}}$ da velocidade ${\displaystyle V_{0}}$ onde ${\displaystyle 0<f_{V{_{0}}}<1}$:

${\displaystyle [{\ce {I}}]=\left({\frac {1}{f_{V{_{0}}}}}-1\right)K_{i}\left(1+{\frac {[{\ce {S}}]}{K_{m}}}\right)}$

(9)

Referências