Teste de oxidase

A prova da oxidase ou teste da oxidase é um teste utilizado em microbiologia para determinar se uma bactéria produz alguma das enzimas citocromo c oxidases.^[1] No teste utilizam-se discos impregnados com o reagente N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina (ou TMFD) ou N,N-Dimetil-p-fenilenodiamina (ou DMFD), que é também um indicador redox. O reagente passa de azul-escuro a grená ao ser oxidado, e torna-se transparente ao ser reduzido. As bactérias oxidase-positivas possuem citocromo oxidase ou indofenol oxidase (uma hemoproteína).^[2] Ambas as enzimas catalisam o transporte de eletrões de compostos dadores (NADH) para aceitadores de eletrões (geralmente o oxigénio). No teste, o reagente TMFD atua como dador artificial de eletrões para a enzima oxidase. O reagente oxidado forma o composto colorido de indofenol azul. O sistema citocromo está normalmente presente apenas nos organismos aeróbios que podem utilizar o oxigénio como aceitador final de eletrões e hidrogénio. O produto final deste metabolismo pode ser água ou peróxido de hidrogénio (molécula tóxica que será quebrada pela catalase).^[3]

As estirpes testadas podem ser oxidase-positivas (OX+) ou oxidase-negativas (OX-).

Significa que a bactéria possui citocromo c oxidase, pelo que pode usar o oxigénio para a produção de energia numa cadeia de transporte de eletrões. Um exemplo de identificação preliminar é a dos géneros Neisseria e Moraxella, que são ambos diplococos gram-negativos oxidase-positivos. Muitos gram-negativos, como os bacilos curvos como Helicobacter pylori, Vibrio cholerae e Campylobacter jejuni são oxidase-positivos. Outros géneros oxidase-positivos são Pseudomonas, Aeromonas e Alcaligenes.^[4]

As enterobactérias são exemplos típicos de bactérias oxidase-negativas.^[5] O resultado negativo indica que não possuem citocromo c oxidase, o que significa que não podem usar o oxigénio na cadeia de transporte de eletrões ou, então, que utilizam um citocromo diferente para a transferência de eletrões para o oxigénio.

1. Humedece-se cada disco (que contém o reagente) com a ansa bacteriológica com cerca de quatro gotas de água desionizada.
2. Com a ansa, transfere-se uma grande massa de bactérias puras para o disco.
3. Observa-se o disco durante três minutos. Nesse tempo, a área de inoculação deve mudar para uma cor entre azul-escura e grená ou mesmo preto; se isto ocorrer, o resultado do teste é positivo. Se não houver mudança nesse tempo, o teste é negativo.

Uma maneira alternativa de fazer o teste é preparar bactérias cultivadas em placas de ágar tripticase-soja utilizando uma técnica assética, fazendo uma inoculação numa única estria. As placas inoculadas são incubadas a 37 °C durante 24–48 horas para que se formem colónias. Devem utilizar-se preparações bacterianas frescas. Uma vez que as colónias tenham crescido no meio, adicionam-se duas ou três gotas do reagente DMPD sobre a superfície de cada tipo de organismo a ser testado. A prova é positiva (OX+) se mudar a cor para violeta ou púrpura, em 10–30 segundos. A prova é negativa (OX-) se a cor for rosa-clara ou se houver ausência de coloração.

Outros métodos também utilizados com o reagente TMPD são:

1. Método em placa direta: Adicionar diretamente 2-3 gotas de reagente a algumas colónias. Não inundar toda a placa e não a inverter. Observar as mudanças de cor. Com o reagente de Kovacs (TMPD) a reação ocorre em cerca de 10-15 segundos, enquanto que com o de Gordon e McLeod (DMPD) ocorre em 10-30 minutos. O TMPD (solução aquosa a 1% de TMPD ou reagente de Kovacs) é menos tóxico e mais sensível mas mais caro que o DMPD (reagente de Gordon e McLeod).
2. Método indireto sobre papel: Colocar um pedaço de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente numa placa de Petri. Adicionar 2-3 gotas do reagente de Kovacs (TMPD) no centro do papel. Espalhar com a ansa de sementeira uma colónia sobre o papel impregnado. A reação de cor positiva ocorre aos 5-10 segundos.

Referências