Complexo promotor da anáfase

O complexo promotor de anáfase ou ciclossoma, também designado, pelo seu acrónimo, APC ou APC/C (Complexo Promotor de Anáfase/Ciclossoma), é uma E3 ubiquitina ligase que marca as proteínas alvo do ciclo celular para degradação no proteossoma de 26S. O APC/C é um grande complexo de 11 a 13 proteínas subunidade, entre as quais se encontram uma culina (Apc2) e a subunidade RING (Apc11) semelhante ao complexo SCF. Outras partes do APC/C têm funções desconhecidas, mas são altamente conservadas.^[1]

A descoberta do APC/C (e do SCF) e o seu papel fundamental na regulação do ciclo celular eucariótico estabeleceram a importância da proteólise mediada pela ubiquitina na biologia celular. A ubiquitinação e a subsequente degradação de proteínas pelo proteossoma, anteriormente percebida como um sistema envolvido exclusivamente na remoção de proteínas danificadas da célula, é hoje considerada um mecanismo regulador universal para a transdução de sinal, cuja importância se aproxima da da fosforilação de proteínas.

Em 2014, o APC/C foi mapeado em 3D com uma resolução inferior a um nanómetro, o que serviu também para descobrir a sua estrutura secundária. Esta descoberta pode melhorar a nossa compreensão do cancro e revelar novos locais de ligação para futuros medicamentos anticancerígenos.^[2][3]

A principal função do APC/C é desencadear a transição da metáfase para a anáfase através da marcação de proteínas específicas para degradação. Os três principais alvos para a degradação da APC/C são a securina e as ciclinas S e M. A securina liberta separase, uma protease, quando é degradada. De seguida, a separase desencadeia o corte ou clivagem da coesina, o complexo proteico que mantém as cromátides irmãs unidas. Durante a metáfase, as cromátides irmãs estão ligadas entre si por complexos de coesina intactos. Quando a securina sofre ubiquitinação pelo APC/C e liberta separase, que degrada a coesina, as cromátides irmãs ficam livres para se deslocarem para pólos opostos do fuso na anáfase. A APC/C tem também como alvo a degradação das ciclinas mitóticas, resultando na inativação de M-CDK (complexos de cinase dependente de ciclina mitótica), promovendo a saída da mitose e da citocinese.^[1]

Ao contrário do SCF, várias subunidades ativadoras controlam o APC/C. A Cdc20 e a Cdh1 são dois ativadores de particular importância para o ciclo celular. Estas proteínas ativam o APC/C contra conjuntos específicos de substratos em diferentes momentos do ciclo celular, o que faz com que o ciclo progrida. A APC/C desempenha também um papel integral na manutenção do metabolismo da cromatina, especialmente nas fases G₁ e G₀, e desempenha um papel fundamental na fosforilação da histona H3 através da destruição da aurora A quinase.^[4]

Os substratos críticos do APC/C parecem ser a securina e as ciclinas do tipo B. Isto é conservado entre mamíferos e leveduras. De facto, uma levedura é viável na ausência do APC/C se a necessidade de atacar estes substratos for eliminada.^[5]

Não há muita investigação sobre as subunidades do APC/C, que funcionam principalmente como adaptadores. Os estudos de subunidades de APC são conduzidos principalmente em leveduras, e estes estudos mostram que a maioria das subunidades de APC de leveduras também estão presentes em vertebrados; isto sugere a conservação de subunidades em eucariotas. Foram encontradas onze subunidades principais do APC em vertebrados e treze em leveduras.^[1] As subunidades activadoras ligam-se ao APC em várias fases do ciclo celular para controlar a sua actividade de ubiquitinação, geralmente direccionando o APC para substratos alvo destinados à ubiquitinação. Foi proposto que a especificidade das ligases APC é controlada pela incorporação de fatores de especificidade no complexo da ligase, em vez da fosforilação do substrato. A subunidade CDC20 permite que o APC degrade substratos como os inibidores da anáfase (Pdsp1) no início da anáfase; Por outro lado, quando o CDC20 é substituído pelo fator de especificidade Hct1, o APC degrada um conjunto diferente de substratos, particularmente as ciclinas mitóticas na anáfase tardia. Os ativadores CDC20 e Cdh1 são de particular importância e são as subunidades mais amplamente estudadas e comuns do APC/C.

O centro catalítico do APC/C é constituído pela subunidade cullina Apc2 e pela subunidade do domínio RING H2 Apc11. Estas duas subunidades catalisam a ubiquitinação de substratos quando o domínio C-terminal de Apc2 forma um complexo fortemente ligado com Apc11. RING/APc11 liga-se ao conjugado E2-ubiquitina que catalisa a transferência de ubiquitina para um sítio activo E2.^[1] Para além da funcionalidade catalítica, outras proteínas no centro do complexo APC são compostas por múltiplos motivos repetidos com o propósito principal de fornecer suporte de estrutura molecular. Isto inclui a Apc1, a maior subunidade contendo 11 repetições em tandem de sequências de 35–40 aminoácidos, e a Apc2, que contém três repetições de culina de aproximadamente 130 aminoácidos no total.^[6] Os principais motivos nas subunidades de APC incluem motivos tetratricopeptídicos (TPR) e repetições WD40.^[1] As regiões C-terminais de CDC20 e Cdh1 têm um domínio WD40 que é sugerido para formar uma plataforma de ligação que se liga a substratos de APC, contribuindo assim para a capacidade de APC de atacar estes substratos, embora o mecanismo exato pelo qual este aumento na atividade da APC ocorre seja desconhecido.^[7] Foi também sugerido que variações nestes domínios WD40 resultam em variações na especificidade do substrato, o que foi confirmado em estudos recentes que indicam que diferentes substratos de APC podem ligar-se direta e especificamente a Cdc20 e Cdh1/Hct1. Por fim, as diferenças na especificidade são responsáveis ​​pela ordem e pelo momento da destruição de vários alvos de APC durante a mitose, de modo que o CDC20 ataca alguns substratos principais na metáfase e o Cdh1 ataca um conjunto mais amplo de substratos no final da mitose e na fase G1.^[8]

As 4 subunidades do APC/C da levedura consistem inteiramente em múltiplas repetições do motivo tetratricopeptídico (TPR) de 34 resíduos de aminoácidos. Estas subunidades TPR, Cdc16,^[9] Cdc27,^[10]Cdc23 e Apc5 fornecem principalmente uma estrutura e suporte para interações proteína-proteína mediadas por outros. Cdc27 e Cdc23 suportam a ligação de Cdc20 e Cdh1, uma vez que as mutações em resíduos chave destas subunidades causam um aumento da dissociação dos ativadores. Apc10/Doc1 promove a ligação do substrato através da mediação das suas interações com Cdh1 e Cdc20.^[11]

Especificamente, o CDC20 (também designado p55CDC, Fizzy ou Slp1) inativa o CDK1 através da ubiquitinação das ciclinas do tipo B. Isto resulta na ativação do Cdh1 (também designado por Fizzy-related, Hct1, Ste9 ou Srw1), que interage com o APC durante a mitose tardia e G1/G0. O Cdh1 é inativado por fosforilação durante as fases S, G2 e M inicial. Durante estes momentos do ciclo, não pode ser montado.^[12]

APC 3 e APC7 servem para recrutar Cdh1 no complexo promotor da anafase.^[13] Isto reforça também que o Cdh1 é responsável pela manutenção da atividade do APC durante o G1. O Cdh1 não requer que o APC seja fosforilado e se ligue; na verdade, a fosforilação do Cdh1 pelas Cdks impede que este se ligue ao APC da fase S para a fase M. Com a destruição do M-Cdk, a libertação do CDC20 do APC e a ligação do Cdh1 podem agora ocorrer, permitindo que a atividade do APC continue durante a entrada em G1.^[1] Enquanto o Cdh1 reconhece as ciclinas M e S, permitindo a sua destruição até que toda a célula esteja determinada a avançar para um novo ciclo, não reconhece as ciclinas G1/S e, durante a fase G1/S, a atividade da ciclina pode aumentar livremente e fosforilar, e assim inativar, Cdh1 e, portanto, a APC.

A subunidade Apc15 desempenha um papel importante na ativação de APC/C^Cdc20 após biorientação da cromátide irmã na placa metafásica. Quando os cinetócoros não estão ligados ao fuso, os complexos de ponto de verificação mitótico (MCCs) inibem o APC. Na ausência de Apc15, os MCCs e o Cdc20 permanecem bloqueados no APC/C, impedindo a sua atividade quando os requisitos do ponto de verificação do fuso são cumpridos. O Apc15 medeia a rotatividade do Cdc20 e dos MCCs para fornecer informações sobre o estado de fixação do cinetócoro.^[14]

Uma das subunidades que exibe o motivo TPR, CDC27, demonstrou interagir com proteínas de ponto de verificação mitótico, como Mad2, p55CDC e BUBR1, indicando que pode estar envolvida na sincronização de eventos na fase M.^[15] Existem evidências de que CDC27 faz parte de um complexo ternário com SMAD2/3 e Cdh1, que é formado em resposta à sinalização de TGFβ. Devido à sua interação com o Cdh1 em particular, tem um possível papel na determinação da afinidade entre o APC e os seus ativadores Cdc20 e Cdh1. Um estudo sugere que a fosforilação de Cdc27 induzida por TGF-β aumenta a interação entre Cdc27 e Cdh1, que está diretamente envolvida na ativação de APC.^[16] Os substratos críticos do APC/C parecem ser a securina e as ciclinas do tipo B. Isto é conservado entre mamíferos e leveduras. De facto, uma levedura é viável na ausência de APC/C se a necessidade de atacar estes substratos for eliminada.

A CDC23, outra subunidade contendo TPR, interage com a SWM1, ligando-se à caixa D da CLB2. Com base em ensaios híbridos in vivo e co-imunoprecipitação in vitro, foi sugerido que Cdc16p, Cdc23p e Cdc27p (análogos em Saccharomyces cerevisiae) interagem e formam um complexo macromolecular. Foi observado que o seu tema comum de TPR medeia estas interações.^[17] Quanto ao Cdc27 e Cdc16 em Drosophila, as suas funções foram testadas por ARN interferente (RNAi).^[18] Os resultados sugerem que podem mediar a atividade de todo o complexo por diferentes mecanismos em diferentes locais. Noutros estudos em Drosophila, Cdk16 e Cdk23 parecem ser activadas pela fosforilação da cinase 1 semelhante à Polo (Plk1), e a molécula correspondente da levedura de fissão parece ligar-se especificamente à Cdc23.^[19]

O complexo é regulado pelos ativadores CDC20 e Cdh1 durante a mitose. O seu papel na degradação da ciclina B é demonstrado por um rastreio de mutantes de Saccharomyces cerevisiae defeituosos para a degradação da ciclina B, que apresentam mutações nos genes CDC16 e CDC23. Nos mutantes para CDC27, CDC23 e CDC 27, a paragem do ciclo celular ocorre em todos os casos na metáfase.^[20]

Os substratos APC/C possuem sequências de aminoácidos de reconhecimento que permitem ao APC/C identificá-los. A sequência mais comum é conhecida como "caixa de destruição" ou caixa D. O APC/C liga-se a uma enzima conjugadora de ubiquitina E2 e D-box em vez de ser um transportador intermédio covalente.^[21] A caixa D deve ter uma versão da seguinte sequência de aminoácidos: RXXLXXXXN, em que R é arginina, X é um aminoácido qualquer, L é leucina e N é asparagina. A caixa KEN (ou Ken) é outro motivo de importância. A sua sequência deve ser semelhante à seguinte: KENXXXN, em que K é lisina e E é glutamato. O aminoácido na última posição da caixa KEN é altamente variável. Embora tenha sido demonstrado que as mutações de sequência inibem a destruição de proteínas in vivo, ainda há muito a aprender sobre a forma como o APC/C se liga a proteínas específicas.^[1]

Uma vez ligadas ao APC/C, as proteínas Cdc20 e Cdh1 funcionam como recetores D e KEN para vários substratos da APC. Kraft e outros. mostraram que as caixas D dos substratos se ligam diretamente à região propulsora das repetições WD40 altamente conservadas nos ativadores da APC. É importante notar que a área promotora conservada de Cdh1 é muito maior do que a de Cdc20, permitindo que Cdh1 tenha uma especificidade de substrato mais ampla, o que é consistente com o facto de APC/C^Cdh1 também ativar a destruição mediada por APC de substratos contendo a caixa KEN. A caixa D aumenta ainda mais a degradação proteica, uma vez que os resíduos de lisina próximos da caixa D servem como alvos de ubiquitilação. Verificou-se que um resíduo de lisina imediatamente C-terminal à caixa D pode funcionar como aceitador de ubiquitina.^[22]

Muitos substratos APC contêm caixas D e KEN, e a sua ubiquitilação por APC/C^Cdc20 ou APC/C^Cdh1 depende de ambas as sequências, embora alguns substratos contenham apenas caixa D ou caixa KEN, numa ou várias cópias. Ter duas sequências de degradação distintas cria um elevado nível de especificidade de substrato no APC/C, sendo o APC/C^Cdc20 mais dependente da caixa D e o APC/C^Cdh1 mais dependente da caixa KEN. Por exemplo, o APC/C^Cdh1 pode ubiquitalizar substratos que contêm apenas a caixa KEN, como o Tome-1 e a sororina.^[6]

Embora Cdc20 e Cdh1 possam servir como recetores para as caixas D e KEN, a baixa afinidade destas interações coativador-substrato sugere que é improvável que os coativadores por si só sejam suficientes para fornecer uma elevada afinidade de ligação ao substrato para APC/C^Cdc20 e APC/C^Cdh1.^[6] Consequentemente, as subunidades principais de APC/C, como Apc10, também contribuem para a associação ao substrato. Em construções APC/C sem a subunidade Apc10/Doc1, substratos como Clb2 não conseguiram associar-se a APC^Δdoc1–Cdh1, enquanto que a adição de Doc1 purificado à construção APC^Δdoc1–Cdh1 restaurou a capacidade de ligação do substrato.^[11]

Quando a metáfase começa, o ponto de verificação do fuso inibe o APC/C até que todos os cinetócoros irmãos estejam ligados aos pólos opostos do fuso mitótico, um processo denominado biorientação cromossómica. Quando todos os cinetócoros estão corretamente ligados, o ponto de verificação do fuso é silenciado e o APC/C pode ser ativado. Os M-Cdks fosforilam subunidades no APC/C que promovem a ligação ao Cdc20. As ciclinas Securina e M (ciclinas A e B) são alvos de degradação do APC/C^Cdc20. Uma vez degradada, a separina é libertada, a coesina é degradada e as cromátides irmãs são preparadas para se deslocarem para os seus respectivos pólos na anáfase.^[1]

Em células animais, é provável que ocorra pelo menos alguma ativação de APC/C^Cdc20 no início do ciclo celular (prófase ou prometáfase) com base no momento da degradação dos seus substratos. A ciclina A é degradada no início da mitose, o que suporta esta teoria, mas a ciclina B e a securina não são degradadas até à metáfase. A base molecular deste atraso é desconhecida, mas pensa-se que é fundamental para a sincronização adequada do início da anáfase. Nas células animais, o sistema de ponto de verificação do fuso contribui para o atraso, caso a biorientação dos cromossomas necessite de ser corrigida. No entanto, não se sabe como o sistema de ponto de verificação do fuso inibe a destruição da ciclina B e da securina, ao mesmo tempo que permite que a ciclina A seja degradada. O atraso pode também ser explicado por interacções desconhecidas com os reguladores, localização e alterações na fosforilação.^[1]

Isto inicia um ciclo de feedback negativo. Embora o M-Cdk seja necessário para a ativação de APC/C^Cdc20, o complexo é também responsável por clivar a ciclina para inativar o M-CdK. Isto significa que o APC/C^Cdc20 promove a sua própria desativação. É possível que este feedback negativo seja a espinha dorsal da actividade da Cdk controlada pelas oscilações nas concentrações de ciclina M e S.^[1]

Uma vez concluída a mitose, é importante que as células (exceto as do embrião) passem por um período de crescimento, conhecido como fase G₁, para crescerem e produzirem os fatores necessários para o próximo ciclo celular. A entrada noutra ronda de mitose é impedida pela inibição da atividade da Cdks. Embora diferentes processos sejam responsáveis ​​por esta inibição, um importante é a ativação de APC/C por Cdh1. Esta ativação contínua previne a acumulação de ciclinas que desencadeariam outra ronda de mitose e, em vez disso, impulsiona a saída da mitose.^[1]

No início do ciclo celular, o Cdh1 é fosforilado pelo M-Cdk, impedindo a sua ligação ao APC/C. O APC/C fica então livre para se ligar ao Cdc20 e orientar a transição da metáfase para a anáfase. À medida que o M-Cdk é degradado na mitose tardia, o Cdc20 é libertado e o Cdh1 pode ligar-se ao APC/C, mantendo-o ativado durante a transição M/G₁. Uma diferença fundamental é que, enquanto a ligação do Cdc20 ao APC/C depende da fosforilação do APC/C pelos Cdks mitóticos, a ligação do Cdh1 não depende. Assim, quando o APC^Cdc20 se torna inativado durante a metáfase devido à desfosforilação resultante da inativação das Cdks mitóticas, o Cdh1 pode ligar-se imediatamente ao APC/C, ocupando o lugar do Cdc20. O Cdc20 é também um alvo do APC/C^Cdh1, garantindo que o APC/C^Cdc20 deixa de funcionar. De seguida, APC/C^Cdh1 continua a trabalhar em G₁ para marcar as ciclinas S e M para destruição. No entanto, as ciclinas G₁/Sr não são substratos APC/C^Cdh1 e, por isso, acumulam-se durante esta fase e fosforilam Cdh1. Na fase G₁ tardia, acumularam-se ciclinas G₁/S suficientes e Cdh1 fosforilada para inactivar o APC/C até à metáfase seguinte.^[1]

Uma vez em G₁, a APC^Cdh1 é responsável pela degradação de várias proteínas que promovem a correta progressão do ciclo celular. A Geminin é uma proteína que se liga ao Cdt1, impedindo a sua ligação ao complexo de reconhecimento de origem (ORC). APC^Cdh1 atua sobre a geminina para a ubiquitinação ao longo de G₁, mantendo os seus níveis baixos. Isto permite que o Cdt1 execute a sua função durante a pré-montagem RC. Quando o APC^Cdh1 se torna inativo devido à fosforilação de Cdh1 pelas ciclinas G¹/S, a atividade da geminina volta a aumentar. Além disso, o Dbf4 estimula a atividade da Cdc7, que promove a ativação das origens de replicação. Pensa-se que o APCCdh1 tem como alvo o Dbf4 para destruição. Isto poderá fornecer uma resposta sobre a forma como o Cdc7 é ativado no início de um novo ciclo celular. A sua atividade corresponde provavelmente à inativação de APC/C^Cdh1 pelas ciclinas G/S.^[1]

A inativação do APC/C^Cdc20 durante as fases iniciais do ciclo celular é conseguida em parte pela ação da proteína Emi1. Experiências iniciais mostraram que a adição de Emi1 aos extratos do ciclo celular de Xenopus pode impedir a destruição das ciclinas endógenas A e B e a saída da mitose, sugerindo que Emi1 pode contrariar a atividade da APC. Além disso, a depleção de Emi1 nas células somáticas leva à falta de acumulação de ciclina B. A falta de Emi1 leva provavelmente à falta de inibição de APC, impedindo a acumulação de ciclina B.^[23]

Destas observações iniciais, confirmou-se que em G2 e no início da mitose, Emi1 se liga e inibe Cdc20, impedindo a sua associação com substratos de APC. O Cdc20 pode ainda ser fosforilado e liga-se ao APC/C, mas a ligação do Emi1 bloqueia a interação do Cdc20 com os alvos do APC.^[1] A associação de Emi1 com Cdc20 permite a estabilização de várias ciclinas através das fases S e G2, mas a remoção de Emi1 é essencial para a progressão através da mitose. Assim, na prófase tardia, o Emi1 é fosforilado pela Polo-like kinase (Plk). Plk é ativado durante o início da mitose pela ação de Cdk1, e a sua fosforilação de Emi1, ligação a βTrCP e ubiquitinação, torna Emi1 um alvo para SCF, levando à sua subsequente destruição na prometáfase.^[24] A destruição de Emi1 leva à ativação de APC/CCdc20, permitindo a destruição da ciclina A no início da mitose. Os níveis de Emi1 começam novamente a aumentar na fase G, o que ajuda a inibir APC/C^Cdh1.^[1]

A regulação da atividade APC/C^Cdc20 em substratos de metáfase, como a securina e a ciclina B, pode ser o resultado da localização intracelular. Coloca-se a hipótese de que as proteínas de ponto de verificação do fuso que inibem a APC/C^Cdc20 se associam apenas a um subconjunto da população de moléculas Cdc20 localizadas perto do fuso mitótico. Assim, a ciclina A pode ser degradada, enquanto a ciclina B e a securina só são degradadas quando as cromátides irmãs atingem a biorientação.^[1]

Referências

• Visintin R, Prinz S, Amon A (outubro de 1997). «CDC20 and CDH1: a family of substrate-specific activators of APC-dependent proteolysis». Science. 278 (5337): 460–3. Bibcode:1997Sci...278..460V. PMID 9334304. doi:10.1126/science.278.5337.460 
• Hsu JY, Reimann JD, Sørensen CS, Lukas J, Jackson PK (maio de 2002). «E2F-dependent accumulation of hEmi1 regulates S phase entry by inhibiting APC(Cdh1)». Nature Cell Biology. 4 (5): 358–66. PMID 11988738. doi:10.1038/ncb785 
• Zachariae W, Nasmyth K (agosto de 1999). «Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex». revisión. Genes & Development. 13 (16): 2039–58. PMID 10465783. doi:10.1101/gad.13.16.2039 
• Harper JW, Burton JL, Solomon MJ (setembro de 2002). «The anaphase-promoting complex: it's not just for mitosis any more». revisión. Genes & Development. 16 (17): 2179–206. PMID 12208841. doi:10.1101/gad.1013102 
• Lima M, Eloy NB, Pegoraro C, Sagit R, Rojas C, Bretz T, et al. (novembro de 2010). «Genomic evolution and complexity of the Anaphase-promoting Complex (APC) in land plants». BMC Plant Biology. 10. 254 páginas. PMC 3095333. PMID 21087491. doi:10.1186/1471-2229-10-254 

• MeSH anaphase-promoting+complex
• Estruturas de microscopia electrónica en 3D do complexo promotor da anafase no EM Data Bank(EMDB)