Fragmento de Klenow
O fragmento de Klenow é um fragmento proteico de grandes dimensões com actividade enzimática da ADN polimerase I da bactéria E. coli. Surge quando esta ADN polimerase I é clivada pela protease subtilisina, que remove uma porção, e o que resta é o fragmento de Klenow. Foi obtido em 1970 por H. Klenow et al.[1] Comparativamente à enzima completa, o fragmento de Klenow mantém as atividades 5’ → 3’ polimerase e 3’ → 5’ exonuclease para remoção de nucleótidos pré-codificados e correção de prova, mas perdeu a atividade de exonuclease 5’ → 3’ que a enzima completa também possuía.
O outro pequeno fragmento resultante da clivagem desta polimerase mantém a atividade de exonuclease 5’ → 3’, mas não possui as outras duas atividades do fragmento de Klenow.
Pesquisa
Uma vez que a atividade de exonuclease 5’ → 3’ da E. coli DNA polimerase I torna esta enzima inadequada para muitas aplicações, o fragmento de Klenow, que não possui esta atividade, tem muitas aplicações na investigação. O fragmento de Klenow é muito útil em tarefas de investigação que envolvam o seguinte:
- Síntese de ADN bicatenário a partir de moldes de cadeia simples.
- Completar uma extremidade 3’ que foi encurtada a partir de um fragmento de ADN para uniformizar a extremidade 5’ saliente.
- Digerir as extremidades 3' salientes.
- Preparar sondas de ADN radioativas.
O fragmento de Klenow foi também a enzima originalmente utilizada para a amplificação de segmentos de ADN na reação em cadeia da polimerase (PCR),[2] mas foi posteriormente substituído nesta técnica por enzimas termoestáveis, como a Taq polimerase,[3] que apresentou melhores resultados.
O fragmento exo-Klenow
Assim como para certas tarefas a actividade exonuclease 5' → 3' da DNA polimerase I de E. coli era inconveniente, para certas aplicações a actividade exonuclease 3' → 5' que o fragmento de Klenow mantém é também indesejável. Este problema pode ser resolvido introduzindo mutações no gene que o codifica. Como resultado, são expressas formas da enzima que possuem atividade polimerase 5’ → 3’, mas carecem de atividade exonuclease, uma vez que o sítio ativo correspondente é afetado. Esta forma da enzima é designada por fragmento exo-Klenow ou fragmento de Klenow sem exo.[4]
O fragmento exo-Klenow é utilizado em algumas reações de marcação fluorescente para microarranjos, entre outras.
Notas
Referências
- ↑ Klenow H and Henningsen I (1970). «Selective Elimination of the Exonuclease Activity of the Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Escherichia coli B by Limited Proteolysis». Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65 (1): 168–175. PMC 286206
. PMID 4905667. doi:10.1073/pnas.65.1.168
- ↑ Saiki RK; et al. (1985). «Amplificação Enzimática das Sequências Genómicas da β-globina e Análise dos Sítios de Restrição para o Diagnóstico da Anemia Falciforme». Science. 230: 1350–54. PMID 2999980. doi:10.1126/science.2999980
- ↑ Saiki; et al. (1988). «Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase». Science. 239: 487–91. PMID 2448875. doi:10.1126/science.2448875
- ↑ «Thermo Scientific». Consultado em 25 de agosto de 2013. Cópia arquivada em 4 de abril de 2014
Ver também
Ligações externas
- MeshName - Klenow+Fragment [1]
- Diagrama en vivo.colostate.edu