Experimento de Avery–MacLeod–McCarty

O experimento de Avery–MacLeod–McCarty foi uma demonstração experimental conduzida por Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty, publicada em 1944, que revelou que o DNA é a substância responsável pela transformação bacteriana. Na época, acreditava-se amplamente que as proteínas eram as portadoras da informação genética, com o próprio termo "proteína" sendo criado para indicar sua função considerada "primária". O experimento foi o ápice de pesquisas realizadas na década de 1930 e início do século XX no Instituto Rockefeller de Pesquisa Médica, com o objetivo de purificar e caracterizar o "princípio transformador" descrito inicialmente no experimento de Griffith de 1928. Nesse experimento, pneumococos mortos da cepa virulenta tipo III-S, quando injetados junto com pneumococos vivos, mas não virulentos, do tipo II-R, resultavam em uma infecção fatal pelo tipo III-S. No artigo "Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types: Induction of Transformation by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from Pneumococcus Type III", publicado na edição de fevereiro de 1944 do Journal of Experimental Medicine [en], Avery e seus colegas sugeriram que o DNA, e não a proteína como se acreditava, poderia ser o material hereditário das bactérias, com possíveis analogias a genes e/ou vírus em organismos superiores.^[1][2]

Com o desenvolvimento da tipagem sorológica [en], pesquisadores conseguiram classificar bactérias em diferentes cepas, tipos ou estirpes. Quando uma pessoa ou animal de teste (como um camundongo) é inoculado com um tipo específico, ocorre uma resposta imune, gerando anticorpos que reagem especificamente com antígenos da bactéria. O soro sanguíneo contendo esses anticorpos pode ser extraído e aplicado a bactérias cultivadas, que reagirão com outras bactérias do mesmo tipo da inoculação original. Fred Neufeld [en], bacteriologista alemão, descobriu os tipos pneumocócicos e a tipagem sorológica. Até os estudos de Frederick Griffith, acreditava-se que os tipos bacterianos eram fixos e imutáveis de uma geração para a seguinte.^[3]

O experimento de Griffith, relatado em 1928,^[4] identificou que um "princípio transformador" em bactérias pneumocócicas poderia transformar um tipo bacteriano em outro. Griffith, médico britânico, dedicou anos à tipagem sorológica em casos de pneumonia, uma doença muitas vezes fatal no início do século XX. Ele observou que diversos tipos (alguns virulentos e outros não virulentos) estavam presentes durante um caso clínico de pneumonia e sugeriu que um tipo poderia se transformar em outro, em vez de múltiplos tipos coexistirem. Ao testar essa possibilidade, ele descobriu que a transformação ocorria quando bactérias mortas de um tipo virulento e bactérias vivas de um tipo não virulento eram injetadas em camundongos, resultando em uma infecção fatal (normalmente causada apenas por bactérias vivas do tipo virulento), com bactérias virulentas sendo isoladas dos camundongos infectados.^[5]

As descobertas de Griffith foram logo confirmadas, primeiro por Fred Neufeld^[6] no Instituto Koch e por Martin Henry Dawson no Instituto Rockefeller.^[7] Pesquisadores do Instituto Rockefeller continuaram estudando a transformação nos anos seguintes. Com Richard H. P. Sia, Dawson desenvolveu um método para transformar bactérias in vitro (em oposição ao in vivo de Griffith).^[8] Após a saída de Dawson em 1930, James Alloway prosseguiu com os estudos, conseguindo extrair soluções aquosas do princípio transformador até 1933. Colin MacLeod trabalhou na purificação dessas soluções de 1934 a 1937, e o trabalho foi continuado em 1940 e concluído por Maclyn McCarty.^[9][10]

O pneumococo é caracterizado por colônias lisas que possuem uma cápsula de polissacarídeo, responsável por induzir a formação de anticorpos; os diferentes tipos são classificados conforme sua especificidade imunológica.^[1] O procedimento de purificação conduzido por Avery consistiu em matar as bactérias com calor e extrair os componentes solúveis em água salina. Em seguida, as proteínas foram precipitadas com clorofórmio, e as cápsulas de polissacarídeos foram hidrolisadas com uma enzima. Uma precipitação imunológica induzida por anticorpos tipo-específicos foi usada para verificar a destruição completa das cápsulas. A porção ativa foi então precipitada por fracionamento [en] com álcool, resultando em filamentos fibrosos que podiam ser removidos com uma vareta de agitação.^[1]

Análises químicas indicaram que as proporções de carbono, hidrogênio, nitrogênio e fósforo na porção ativa eram consistentes com a composição química do DNA. Para demonstrar que o DNA, e não uma pequena quantidade de RNA, proteína ou outro componente celular, era responsável pela transformação, Avery e seus colegas realizaram diversos testes bioquímicos. Eles verificaram que tripsina, quimotripsina e ribonuclease (enzimas que degradam proteínas ou RNA) não afetavam a transformação, mas uma preparação enzimática de "desoxirribonucleodepolimerase" (uma preparação bruta, obtida de várias fontes animais, capaz de degradar DNA) destruía a capacidade transformadora do extrato.^[1]

Trabalhos subsequentes, em resposta a críticas e desafios, incluíram a purificação e cristalização, por Moses Kunitz em 1948, de uma DNA depolimerase (desoxirribonuclease I), e estudos precisos de Rollin Hotchkiss, que mostraram que praticamente todo o nitrogênio detectado no DNA purificado provinha da glicina, um produto de degradação da base nucleotídica adenina, com contaminação por proteínas estimada em no máximo 0,02%.^[11][12]

As descobertas do experimento de Avery–MacLeod–McCarty foram rapidamente confirmadas e expandidas para outras características hereditárias além das cápsulas de polissacarídeos. No entanto, houve considerável relutância em aceitar que o DNA era o material genético. Segundo a influente "hipótese do tetranucleotídeo [en]" de Phoebus Levene [en], o DNA consistia em unidades repetitivas de quatro bases nucleotídicas, com baixa especificidade biológica, sendo considerado apenas um componente estrutural dos cromossomos, enquanto os genes seriam provavelmente formados pela componente proteica.^[13][14] Essa visão foi reforçada pela cristalização do vírus do mosaico do tabaco por Wendell Stanley [en] em 1935,^[15] e pelas semelhanças entre vírus, genes e enzimas; muitos biólogos acreditavam que os genes poderiam ser uma espécie de "superenzima", e os vírus, segundo Stanley, eram proteínas com a propriedade de autocatálise, semelhante a muitas enzimas.^[16] Além disso, poucos biólogos acreditavam que a genética poderia ser aplicada a bactérias, que não possuíam cromossomos ou reprodução sexuada. Em particular, muitos geneticistas do chamado American Phage Group, que se tornaria influente na biologia molecular na década de 1950, rejeitavam o DNA como material genético e evitavam as abordagens bioquímicas "desordenadas" de Avery e seus colegas. Alguns biólogos, incluindo Alfred Mirsky, do Instituto Rockefeller, contestaram a afirmação de Avery de que o princípio transformador era DNA puro, sugerindo que contaminantes proteicos eram os responsáveis.^[13][14] Embora a transformação ocorresse em alguns tipos de bactérias, ela não pôde ser replicada em outras bactérias ou em organismos superiores, e sua relevância parecia limitada principalmente à medicina.^[13][17]

Os cientistas que revisitaram o experimento de Avery–MacLeod–McCarty discordaram sobre sua influência nas décadas de 1940 e início de 1950. Gunther Stent sugeriu que ele foi amplamente ignorado, sendo reconhecido apenas posteriormente, semelhante ao trabalho de Gregor Mendel décadas antes do surgimento da genética. Outros, como Joshua Lederberg e Leslie C. Dunn, destacaram sua importância inicial, considerando o experimento o início da genética molecular.^[18]

Alguns microbiologistas e geneticistas já se interessavam pela natureza física e química dos genes antes de 1944, mas o experimento de Avery–MacLeod–McCarty renovou e ampliou esse interesse. Embora a publicação original não mencionasse explicitamente genética, Avery e muitos geneticistas que leram o artigo estavam cientes das implicações genéticas, de que Avery poderia ter isolado o próprio gene como DNA puro. O bioquímico Erwin Chargaff, o geneticista H. J. Muller e outros elogiaram o resultado por estabelecer a especificidade biológica do DNA e por suas implicações para a genética, caso o DNA tivesse um papel semelhante em organismos superiores. Em 1945, a Royal Society concedeu a Avery a Medalha Copley, em parte por seu trabalho em transformação bacteriana.^[19]

Entre 1944 e 1954, o artigo foi citado pelo menos 239 vezes (com citações distribuídas uniformemente ao longo desses anos), principalmente em estudos de microbiologia, imunoquímica e bioquímica. Além do trabalho de acompanhamento de McCarty e outros no Instituto Rockefeller em resposta às críticas de Mirsky, o experimento estimulou avanços significativos em microbiologia, trazendo novas ideias sobre as analogias entre a hereditariedade bacteriana e a genética de organismos com reprodução sexuada.^[17] O microbiologista francês André Boivin afirmou ter estendido as descobertas de transformação bacteriana de Avery para Escherichia coli,^[20] embora isso não tenha sido confirmado por outros pesquisadores.^[17] Em 1946, no entanto, Joshua Lederberg e Edward Tatum demonstraram a conjugação bacteriana em E. coli, mostrando que a genética poderia ser aplicada a bactérias, mesmo que o método específico de transformação de Avery não fosse geral.^[21] O trabalho de Avery também motivou Maurice Wilkins a continuar estudos de cristalografia de raios X do DNA, mesmo enfrentando pressão de financiadores para focar em células inteiras, em vez de biomoléculas.^[17]

Apesar do número significativo de citações e das respostas positivas nos anos seguintes à publicação, o trabalho de Avery foi amplamente negligenciado por grande parte da comunidade científica. Embora recebido positivamente por muitos cientistas, o experimento teve pouco impacto na pesquisa genética principal, em parte porque não afetava diretamente os experimentos de genética clássica, nos quais os genes eram definidos por seu comportamento em cruzamentos, e não por sua composição química. H. J. Muller, embora interessado, focava mais em estudos físicos do que químicos do gene, assim como a maioria dos membros do American Phage Group. O trabalho de Avery também foi ignorado pela Fundação Nobel, que mais tarde expressou publicamente arrependimento por não ter concedido a Avery um Prêmio Nobel.^[22]

Na época do experimento de Hershey–Chase em 1952, os geneticistas estavam mais inclinados a considerar o DNA como o material genético, e Alfred Hershey era um membro influente do American Phage Group.^[23][24] Erwin Chargaff demonstrou que a composição de bases do DNA varia entre espécies (contrariando a hipótese do tetranucleotídeo),^[25] e, em 1952, Rollin Hotchkiss publicou evidências experimentais confirmando o trabalho de Chargaff e demonstrando a ausência de proteína no princípio transformador de Avery.^[26] Além disso, o campo da genética bacteriana estava se consolidando, e os biólogos passaram a considerar a hereditariedade em termos semelhantes para bactérias e organismos superiores.^[23][24] Após Hershey e Chase usarem isótopos radioativos para mostrar que era, principalmente, o DNA, e não a proteína, que entrava nas bactérias durante a infecção por bacteriófago,^[27] passou-se a aceitar amplamente que o DNA era o material genético. Apesar de seus resultados experimentais serem menos precisos (eles encontraram uma quantidade não insignificante de proteína entrando nas células junto com o DNA), o experimento de Hershey–Chase não enfrentou o mesmo grau de contestação. Sua influência foi amplificada pela crescente rede do American Phage Group e, no ano seguinte, pela publicidade em torno da estrutura do DNA proposta por Watson e Crick (Watson também era membro do grupo). No entanto, apenas posteriormente, ambos os experimentos provaram definitivamente que o DNA é o material genético.^[23][24]

Referências

• Deichmann, UTE (2004). «Early responses to Avery et al.'s paper on DNA as hereditary material». Historical Studies in the Physical and Biological Sciences (em inglês). 34 (2): 207–32. doi:10.1525/hsps.2004.34.2.207 
• Fruton, Joseph S. (1999). Proteins, enzymes, genes: the interplay of chemistry and biology (em inglês). New Haven, Conn: Yale University Press. ISBN 978-0-300-07608-0 
• Cobb, Matthew; Morange, Michel (1998). A history of molecular biology (em inglês). Cambridge: Harvard University Press. ISBN 978-0-674-00169-5 
• Lehrer, Steven (2006). Explorers of the Body: Dramatic Breakthroughs in Medicine from Ancient Times to Modern Science (em inglês). United States: iUniverse. ISBN 978-0-595-40731-6 
• Fry, Michael (2016). Landmark experiments in molecular biology (em inglês). London, UK: Academic Press. ISBN 9780128020746  |acessodata= requer |url= (ajuda)

• Lederberg J (Fevereiro de 1994). «The transformation of genetics by DNA: an anniversary celebration of Avery, MacLeod and McCarty (1944)». Genetics (em inglês). 136 (2): 423–6. PMC 1205797. PMID 8150273. doi:10.1093/genetics/136.2.423 
• McCarty, Maclyn (1986). The transforming principle: discovering that genes are made of DNA (em inglês). New York: Norton. ISBN 978-0-393-30450-3 
• Stegenga, Jacob (2011). «The chemical characterization of the gene: vicissitudes of evidential assessment». History and Philosophy of the Life Sciences (em inglês). 33 (1): 105–127. PMID 21789957 

• Profiles in Science: The Oswald T. Avery Collection (em inglês)